聚碳酸酯膜性質(zhì)和優(yōu)點

　　與固形物顏色不接近，背景反差大，利于用顯微鏡觀察。

　　可靠的表面吸附，方便樣品分析、縮短分析時間。

　　有*透明的膜，吸附很低，不吸潮。

　　皮重低，沒有顆粒脫落物，超凈過濾，生物學惰性。

　　聚碳酸酯膜一個比較典型的應(yīng)用就是作為載體，本文介紹的是采用了微孔聚碳酸酯膜作為EC和SMC共培養(yǎng)的載體，該模型可以模仿體內(nèi)EC和SMC的組織結(jié)構(gòu)關(guān)系，在此基礎(chǔ)上，利用倒置顯微鏡和透射電鏡觀察了兩種細胞的生長情況和細胞間縫隙連接情況，為下一步研究兩者間的電生理活動提供了保障。

　　注意：EC，即endothelial cell 血管內(nèi)皮細胞。SMC，即smooth muscle cell 和平滑肌細胞

　　一、材料和方法

　　(1)材料。牛主動脈取自健康屠宰小牛;SD大鼠仔鼠(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心);1640培養(yǎng)基(Gibco);加強小牛血清(Hyclone);聚碳酸酯膜(10mm×15mm，厚12μm，孔徑5μm，孔密度2800 mm-2 ，Millipore公司);2g L-1 明膠(Gibco).

　　(2)方法

　　1.牛主動脈EC(BAEC)和仔鼠SMC的分離和鑒定 按我們已建立的方法培養(yǎng)并鑒定牛主動脈EC和仔鼠胸主動脈SMC[7] ，利用2～5代細胞進行實驗。

　　2.EC和SMC的共培養(yǎng) ①聚碳酸酯膜的準備:取聚碳酸酯膜0.15MPa20min高壓消毒后備用，用前用明膠包被，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h，PBS浸洗后接種細胞;②共培養(yǎng):按密度1×104 cm-2 將內(nèi)皮細胞接種于聚碳酸酯膜的一側(cè)，常規(guī)培養(yǎng)24h后翻轉(zhuǎn)聚碳酸酯膜，將平滑肌細胞接種于膜的另一側(cè)，24h后換液，以后每日換液1次，常規(guī)倒置顯微鏡觀察，取接種后1，3和4d共培養(yǎng)標本進行透射電鏡觀察.

　　3.透射電鏡(TEM)標本的準備[8，9] 取出兩側(cè)長有細胞的聚碳酸酯膜，用預(yù)熱的PBS漂洗，然后在含25g L-1 戊二醛，0.1mol L-1 二甲胂酸鈉溶液(pH7)里固定1h，20℃，再用10g L-1 四氧化鋨固定1h，20℃，用1g L-1 的鞣酸染色，1h，20℃，來加強對比，然后用梯度乙醇逐級脫水，之后把標本浸于乙醇-EPON(1 1)中，1h，20℃，zui后用EPON-環(huán)氧樹脂包埋.用刀片將包埋塊切成小塊，垂直細胞層作超薄切片，用150目碳包被的銅網(wǎng)收集，然后用100g L-1 醋酸雙氧鈾和4g L-1 檸檬酸鉛染色.

　　二、結(jié)果

　　1.SMC和EC在聚碳酸酯膜上生長情況，細胞在接種2h后開始在膜上貼附延伸，接種1d后EC逐漸融合，呈單層生長，細胞呈多邊形.SMC在接種1d后細胞之間開始融合，對數(shù)生長，至第2日可見SMC融合，EC外形呈明顯伸長改變，細胞邊界清楚。第3日SMC開始出現(xiàn)細胞分層生長，EC生長減慢.至第4日時兩種細胞出現(xiàn)衰退現(xiàn)象。

　　2.SMC和EC在聚碳酸酯膜上同類和異類細胞間縫隙連接形成的超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡結(jié)果顯示，共培養(yǎng)1d后的EC和SMC在膜上呈單層生長狀態(tài)，可觀察到EC之間的縫隙連接(Fig1)，聚碳酸酯膜孔內(nèi)可見細胞突起(Fig2)，EC和SMC通過微孔之間形成縫隙連接(Fig3)，在縫隙連接形成處可見兩個細胞的質(zhì)膜互相靠攏，其間有2～3nm的縫隙，其中可見電子密度較高的顆粒組成的虛線狀結(jié)構(gòu)。

　　共培養(yǎng)后第3日時，可以看到EC穿過微孔生長到膜的另一側(cè)(Fig4)，到對側(cè)與SMC形成縫隙連接，且縫隙連接形成的多少與共培養(yǎng)的時間有關(guān)，經(jīng)過電鏡觀察到在接種SMC1d后，穿過微孔的EC有30%～40%可以與對側(cè)的SMC形成縫隙連接，而在第3日就可以達到70%～80%。還可以觀察到SMC呈現(xiàn)多層生長現(xiàn)象(Fig5)，至第4日時SMC明顯發(fā)生退變，底層SMC開始分解(Fig6)。

　　聚碳酸酯膜還有其他的應(yīng)用，更多詳情咨詢!